日本对于干细胞治疗肝脏类疾病的研究进展

　　肝移植是终末期肝功能不全的有效改善方法。但是，供需不平衡是一个比较严重得问题，即所需的肝移植数远大于供体器官数。在日本，捐助者长期短缺这个问题一直存在，因此，对于疑难重症得改善越来越期望于再生医学。

　　由于干细胞具有自主的增殖能力和多能性，因此用干细胞进行改善可以成为促进肝脏再生的有效细胞来源。间充质干细胞具有分化可塑性，其可分化为骨，软骨和脂肪等叶肉细胞，外胚层细胞和子宫内膜细胞，并且因为具有肝病抑制作用，细胞凋亡抑制作用和氧化应激抑制作用，所以可以用于改善肝脏疾病。

　　迄今为止，已经报道了13种使用间充质干细胞改善肝疾病的报告，受试者为肝硬化和肝衰竭。其中2项随机比较研究，6项队列研究和5项病例对照研究，在13份报告中，只有1份报告没有明显作用，其他12份报告显示有作用，这表明即使直接使用间充质干细胞，它们也是改善肝病的有效细胞。我们不是原封不动地使用间充质干细胞，而是着眼于通过像肝细胞那样分化，可以期待得到更强大的改善效果，开发了通过稳定、安全性优秀的低分子化合物向肝细胞那样细胞分化诱导技术。此外，结合利用温度响应性培养皿制作细胞膜的技术，开发出了安全性和改善效果高的“肝疾病改善用细胞膜”，具体情况如下：

　　1.诱导间充质干细胞肝细胞分化的低分子量化合物的鉴定

　　我们专注于人类间充质干细胞，它们存在于骨髓中，通常分化为骨骼，软骨和脂肪细胞。膜干细胞被认为是细胞的良好来源，因为它们具有较低的癌变风险，相对容易收集，并且几乎没有道德问题。我们根据先前的报道进行了从人间充质干细胞诱导肝细胞的实验发现，在诱导过程中Wnt /β-catenin途径被抑制（图1A）。此外，抑制Wnt配体的受体Fzd8诱导白蛋白表达（图1B）。即，发现Wnt /β-连环蛋白途径的抑制导致人间充质干细胞的肝细胞分化（图1C）。此外，作为一种稳定，安全的诱导方法，我们重点研究了不使用蛋白质或基因的低分子量化合物，与报道为Wnt /β-catenin途径抑制剂的10种低分子量化合物相比，它们具有最强的肝细胞分化能力。发现六氯苯酚是诱导的化合物。

　　此外，合成了23种已知的Wnt /β-连环蛋白途径抑制剂的新衍生物，并研究了人间充质干细胞诱导肝细胞分化的能力。IC-2强烈诱导人间充质干细胞中白蛋白，C3，TDO2和EpCAM的表达，并以剂量依赖性方式增加糖原合成能力和尿素合成能力（图2）。IC-2被鉴定为一种新型化合物，它比上述六氯酚更强烈地诱导人间充质干细胞的肝细胞分化。

　　图1. Wnt /β-catenin途径和肝细胞分化

　　A. Wnt /β-catenin途径

　　B.通过siRNA引入Wnt配体Fzd8来表达白蛋白

　　C.通过抑制人间充质干细胞中的Wnt /β-catenin途径使肝细胞差异化

　　图2.新型化合物ICs-2的肝细胞分化能力（引自参考书7）

　　A.IC-2的结构式

　　B. IC-2抑制间充质干细胞的Wnt /β-catenin活性作用的浓度依赖性和时间依赖性

　　C. IC-2对肝细胞特异性基因表达的影响

　　D. IC-2对尿素合成能力的影响

　　E. IC-2对白蛋白表达和CEBPα表达的影响（免疫荧光染色）

　　2.用于改善肝病的细胞片的开发及其对急性肝损伤的作用

　　我们专注于东京女子医科大学的冈野光男教授开发的温度响应性细胞片。我们发现间充质干细胞的肝细胞分化诱导性

　　通过将化合物与温度响应性细胞片技术融合，我们认为可以生产预期具有更强改善效果的细胞片。作为特定的细胞片制备方法，将骨髓来源的人间充质干细胞接种在温度响应性培养皿中，向培养液中加入六氯酚和IC-2等低分子量化合物，培养8天，然后进行培养。通过将培养皿从37°C冷却到20°C，可以获得与间充质干细胞不同的肝细胞样薄片（图3）。该细胞片具有一定的肝细胞功能，同时保持间充质干细胞特有的体液因子分泌能力。

　　四氯化碳在NOD / SCID小鼠中诱发了急性肝损伤，并检查了该细胞片的改善和预防作用。即，该研究是在假定进行改善的肝损伤后移植该细胞片的实验系统和假定进行了预防的将该细胞片移植后添加肝损伤的实验系统中进行的，两者均显着减轻了肝损伤。

　　图3.制备用于改善肝病的细胞片的方法

　　将该细胞片移植到肝表面的第1、2和3层的两层中，以增加急性肝损伤，并比较其作用（图4A）。与未移植细胞片的假移植组相比，作为肝功能指标的ALT，AST和总胆红素水平显示出显着的改善效果。也就是说，细胞片移植将ALT和AST值降低到约2/3，总胆红素值降低到1/3或更小。改善肝功能的这种效果取决于移植的细胞片数量。这种改善不仅在肝功能上明显，而且在肝脏的宏观图像上也很明显。即，假植入组的肝表面变为白色并且观察到颗粒状变化，但是在单层移植组中，肝表面的色调和性质降低。此外，可以明确的是，在两层移植和三层移植中，改善效果大（图4B）。比较存活率，与假移植组相比，以两层或三层移植细胞片的组的存活率显着提高（图4C）。还已经发现，由通过用低分子量化合物诱导间充质干细胞分化为肝细胞而获得的细胞制备的细胞片比由间充质干细胞本身制备的细胞片具有显着更高的改善效果。

　　图4.用于改善肝病的细胞片对急性肝损伤的作用

　　A.与细胞片数目有关的改善肝功能的作用

　　B.对细胞片数目和肝脏的宏观图像

　　C.通过细胞片提高存活率的效果比较

　　该细胞片改善肝脏疾病的缓解作用的机理被认为是细胞片促进肝脏再生。我们已经阐明了促进肝脏再生的三种机制（图5）。一方面，随着间充质干细胞的肝细胞化，C3（一种肝细胞特异性蛋白）在细胞膜中的表达增加，并且小鼠肝细胞通过下游C5和C5a与细胞膜接触。它与C5a受体结合。这促进了NF-κB的核易位，增强了IL-6的分泌，作用于gp130（它是IL-6的受体）在自分泌细胞或旁分泌细胞上的作用，并通过下游STAT3增殖肝细胞。可能会增加。其次，EGF受体的激活可能促进细胞增殖。第三，由于其抗氧化作用，硫氧还蛋白的蛋白表达可能增加，而NF-kB易位进入细胞核。我们正在评估这三种作用机制。

　　图5.肝再生促进作用的机制

　　结论

　　我们已经开发出一种用于改善肝病的细胞片。该细胞片是将人间充质干细胞分化为肝细胞并作为细胞片移植的改善方法。尽管即使直接使用间充质干细胞也是有效的肝病细胞，但是通过将它们分化为肝细胞而不是直接使用间充质干细胞，可以期待强大的改善效果。此外，我们已经确定了低分子量化合物作为诱导间充质干细胞稳定和安全分化的方法。另外，尽管在本文中省略了细节，但是我们发现该细胞片强烈抑制肝纤维化。因此，改善肝病的细胞片有望成为急慢性重症肝病的新改善方法。

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