日本干细胞：解析脂肪干细胞微囊泡抗皮肤细胞衰老作用

　　脂肪干细胞微囊泡抗皮肤成纤维细胞衰老作用的研究

　　目的:探讨脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)和脂肪干细胞来源的微囊泡(microvesicles,MVs)在体外环境中对老年人成纤维细胞的抗衰老作用。

　　分析比较MVs与ADSCs对老年人成纤维细胞抗衰老能力的差异,以及单一供体来源的MVs与多个供体来源的混合MVs对成纤维细胞抗衰老能力的差异。

　　由此为MVs应用于临床抗衰老提供一定的实验基础和理论依据。

　　方法:1、从3名20~30岁青年人的脂肪抽吸手术中获取脂肪组织,使用酶消化法分离、培养出细胞。

　　在显微镜下观察该细胞的形态,检测细胞表面标记物CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105,并进行成脂、成骨分化诱导,以鉴定该细胞是否为ADSCs。

　　2、采用低温超高速离心法从ADSCs培养上清中分离提取MVs,通过透射电镜观察、鉴定MVs,储存备用。

　　3、从3名60~80岁老年人手术中切取的健康皮肤组织,分离培养成纤维细胞,光镜下观察细胞形态。

　　4、将ADSCs和MVs分别与成纤维细胞通过Transwell小室建立间接共培养:(1)实验组Ⅰ:单一供体来源的MVs;(2)实验组Ⅱ:多个供体来源的混合MVs;(3)阳性对照组:ADSCs;(4)空白对照组:空白培养基。

　　5、共培养3天后在显微镜下观察各组成纤维细胞共培养后形态的变化,并进行以下实验:A.使用CCK-8法检测共培养后各组成纤维细胞的活性情况;B.进行β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色,检测成纤维细胞的衰老情况;C.分析测定各组成纤维细胞内活性氧(ROS)的含量;D.利用ELISA法测定共培养后成纤维细胞上清液中Ⅰ型前胶原蛋白含量;E.采用Western Blot检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白p16INK4a、p21Cip1以及p53的表达水平。

　　结果:1、从脂肪组织中提取的细胞呈长梭形,细胞表面标记物CD44、CD73、CD90和CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性。

　　在诱导下细胞可成功向成脂和成骨方向分化。

　　2、与ADSCs或MVs共培养后,部分老年人成纤维细胞逐渐由不规则的扁平星状、条索状转变为清晰规则的长梭形。

　　3、CCK-8以及ELISA检测的实验结果提示:MVs与ADSCs与空白对照相比均可增强老年人细胞增殖以及合成I型前胶原蛋白的活性,但是ELISA检测结果提示ADSCs提高成纤维细胞蛋白合成的能力优于MVs。

　　单一供体来源的MVs与多个供体来源的混合MVs增强成纤维细胞增殖的能力没有显著差别。

　　4、SA-β-Gal染色计数、ROS测定和Western Blot检测衰老相关蛋白p16INK4a、p21Cip1、p53的结果显示:与空白对照相比,MVs和ADSCs都具有降低细胞老化相关生物指标的作用,但是ADSCs降低细胞衰老相关指标的能力优于MVs。

　　单一供体来源的MVs与多个供体来源的混合MVs降低细胞老化指标的能力没有明显区别。

　　结论:1、MVs与ADSCs对成纤维细胞均有一定的抗衰老作用,此外ADSCs的抗衰老作用强于MVs。

　　2、单一供体来源的MVs与多个供体来源的混合MVs对成纤维细胞抗衰老的效果无明显差异。

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